关于引起实验兔死亡的病菌？它们双重PCR检测方法建立及初步应用

随着生命科学的迅速发展，兔已成为生命科学研究中不可或缺的实验动物之一。

随着养殖规模的逐渐扩大，实验动物兔(以下简称为实验兔)常发生急性、高致死性的出血性败血症和呼吸道疾病等，严重制约实验兔养殖业的发展。

Pm与RHDV可分别引起以高致病率和高死亡率为特点的兔多杀性巴氏杆菌病和兔出血症，且Pm被报道能够感染人。

Pm与RHDV常与产气荚膜梭菌、兔支气管败血波氏菌等病原菌引起混合感染与继发感染，一旦发病难以清除。

通过临床症状和剖检病变难以准确判定，因此需借助实验检测。

目前，针对疑似感染Pm或RHDV样品的检测通常采用单一PCR方法，一次仅能检测一种病原，操作繁琐，易漏检，不利于疾病的及时诊断和治疗。

因此，建立一种便捷、特异性强、敏感性高、可实现同时检测Pm和RHDV的双重PCR检测技术极为重要。

研究结果显示，kmt1基因和VP60基因分别为Pm和RHDV的特有DNA序列，针对该两个特异性基因设计引物，通过PCR扩增可以特异性的鉴别Pm和RHDV。

因此，本研究根据GenBank中登录的Pm kmt1和RHDVVP60基因序列保守区域，设计2对特异性引物，通过优化各反应条件建立了检测Pm与RHDV的双重PCR方法，为兔多杀性巴氏杆菌病和兔出血症的鉴别检测及其分子流行病学调查提供技术支撑。

材料与方法

主要实验材料

Pm C46-1株、兔源克雷伯菌、铜绿假单胞菌、兔粘液瘤病毒、肺炎链球菌、轮状病毒、魏氏梭菌、毛状芽孢杆菌、无乳链球菌由中国兽医药品监察所提供均由中国兽医药品监察所提供；RHDV CD-56株、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌、产气荚膜梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、禽致病性大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、鼻气管鸟杆菌、约翰不动杆菌均由本实验室分离并保存。

100份疑似感染Pm和RHDV的肺脏样品采自不同实验兔养殖基地。

主要试剂

p MD18-T载体、Eli DH5α感受态细胞由本实验室保存；2×Taq PCR StarMix购自宝日医生物技术(北京)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；RNAiso Plus提取试剂盒、PrimeScript RT试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。

引物的设计与合成

根据GenBank中Pm kmt1基因(LC619668.1)和RHDV VP60基因(FJ212323.1)的保守序列，利用Oligo7.0软件设计特异性引物，由睿博兴科生物技术有限公司合成，合成后的引物稀释至10μmol/μL，并保存于-20℃备用。

重组质粒标准品的构建与鉴定

提取RHDV CD-56株的RNA并反转录为cDNA，提取Pm C46-1株的DNA，分别以上述DNA和cDNA作为模板，dd H2O作为阴性对照，采用引物kmt1-F/R和VP60-F/R，分别经PCR扩增Pm kmt1和RHDV VP60基因，并分别克隆至p MD18-T载体，构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV，经菌液PCR鉴定后由睿博兴科生物技术有限公司测序。

利用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度并换算为拷贝数，分别作为双重PCR的重组质粒标准品。

Pm和RHDV单一PCR退火温度的优化

采用相应的引物分别经单一PCR扩增VP60与kmt1基因的PCR反应体系(20μL):2×Taq PCR StarMix10μL，上、下游引物各1μL (10μmol/L)，模板DNA/cDNA 2μL,dd H2O补足20μL；反应程序为：95℃5 min;94℃50 s、61.5℃～56℃40 s、72℃1 min,33个循环；72℃10 min。

扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

双重PCR反应体系及条件的优化

在Pm和RHDV单一PCR扩增的基础上，以重组质粒标准品p MD-Pm和p MD-RHDV等体积混合后作为模板，采用各病原单一PCR的退火温度经双重PCR扩增。

采用棋盘法优化引物浓度(0.1μmol/L～0.5μmol/L)、循环数(18～38)、模板量(两种质粒标准品等体积混合物0.5μL～4μL)，扩增产物分别经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

特异性试验

提取上文中20种病原的DNA，与Pm的DNA及RHDV的cDNA均测定浓度后，均调整为50 ng/μL后作为模板。

同时设重组质粒p MD-Pm及p MD-RHDV的混合物作为阳性对照，dd H2O作为阴性对照，利用优化的双重PCR方法扩增，评估其特异性。

敏感性试验

将重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV分别10倍倍比稀释(106～100)并等体积混合后作为模板，利用优化的双重PCR方法扩增，评估该方法的敏感性。

重复性试验

利用建立的双重PCR方法进行批内与批间试验，评估该双重PCR方法的重复性及稳定性。

批内重复性试验：取Pm的DNA与RHDV cDNA的混合物经该双重PCR扩增，做3次重复；批间重复性试验：分别于3个不同时间对上述Pm DNA与RHDV cDNA的混合物经双重PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

临床样品检测

将100份来自不同实验兔养殖基地病死兔的肺脏样品加入灭菌PBS研磨，用于细菌检测的样品研磨后经1 000 r/min离心5 min，取上清利用试剂盒提取样品总DNA；用于病毒检测的样品反复冻融3次，1 200 r/min离心取上清液，利用RNAiso Plus试剂盒提取样品总RNA并反转录为cDNA。

取总DNA和cDNA各1μL混合后作为模板，利用本实验建立的双重PCR方法检测；同时利用已报道的检测Pm的常规PCR及检测RHDV的常规PCR方法检测。

比较三者的检测结果，并计算三者的符合率。

3种检测方法均以质粒标准品p MD-Pm和p MD-RHDV等体积混合后作为阳性对照，以dd H2O作为阴性对照。

结果

重组质粒标准品的鉴定结果

以Pm DNA为模板经PCR扩增Pm kmt1基因，结果显示扩增的目的片段521 bp，与预期一致。

将该片段克隆至p MD18-T载体，构建的重组质粒标准品经PCR和测序鉴定，结果显示获得的基因片段与预期kmt1基因片段相符，表明重组质粒标准品p MD-Pm构建正确。

以VP60-F/R为引物，RHDV cDNA为模板经PCR扩增其VP60基因，结果显示扩增的目的片段311 bp，与预期一致。

将该片段克隆至p MD18-T载体，构建的重组质粒标准品经PCR和测序鉴定，结果显示获得的基因与预期的VP60基因片段相符，表明正确构建重组质粒标准品p MD-RHDV。

采用超微量核酸蛋白分析仪测定p MD-Pm和p MD-RHDV重组质粒浓度分别为63.1 ng/μL和41.5 ng/μL，经换算分别为1.79×107拷贝/μL和1.26×107拷贝/μL，将质粒分装置于-20℃备用。

单一PCR退火温度的确定

分别以kmt1-F/R和VP60-F/R为引物，p MD-Pm/p MD-RHDV为模板，采用56℃～61.5℃的退火温度分别经单一PCR扩增，以优化退火温度。

结果显示，退火温度为59℃时，分别能够扩增出Pm 521 bp的kmt1片段和RHDV 311 bp的VP60基因片段，且扩增条带最亮、无引物二聚体产生。

后续以59℃为退火温度优化双重PCR的反应条件。

双重PCR方法反应条件的优化及扩增结果

以59℃为退火温度经双重PCR扩增，能够同时扩增出Pm 521 bp的kmt1基因片段和RHDV 311 bp的VP60基因片段；阴性对照组无扩增条带。

采用棋盘法优化后的双重PCR反应体系为20μL，包括：2×Taq PCR StarMix 10μL,kmt1-F/R各0.5μL (10μmol/L),VP60-F/R各0.5μL (10μmol/L)，模板p MD-Pm和p MD-RHDV各1μL,dd H2O补足20μL；最佳反应条件为：95℃5 min;94℃50 s、59℃40 s、72℃1 min,33个循环；72℃10 min。

分别以重组质粒标准品p MD-Pm和p MD-RHDV的混合物、重组质粒标准品p MD-Pm、p MD-RHDV为模板，利用优化后的双重PCR反应体系和条件扩增。

结果显示，可分别或同时扩增出约521 bp和311 bp的目的条带，且扩增的目的片段均经测序鉴定正确。

表明本研究设计的引物能特异性地扩增出目的片段。

特异性试验结果

分别以各病原的DNA或cDNA为模板，利用优化的双重PCR扩增。

结果显示：Pm的DNA和RHDV的cDNA以及阳性对照均能够扩增出目的条带，而以金黄色葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等20种病原的核酸(50 ng/μL)及dd H2O为模板时均无扩增条带，表明该方法的特异性较强。

敏感性试验结果

将重组质粒标准品p MD-Pm从1.79×106拷贝/μL稀释至1.79×100拷贝/μL，重组质粒p MD-RHDV从1.26×106拷贝/μL稀释至1.26×100拷贝/μL，等体积混合后取2μL作为模板，经建立的双重PCR扩增。

结果显示，该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL，对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL，表明该方法的敏感性较高。

重复性试验结果

利用建立的双重PCR方法分别检测Pm DNA与RHDV cDNA的混合物，评估该方法的批内和批间重复性。

批内重复性试验结果显示，3次重复检测的Pm DNA与RHDV cDNA的混合物均出现预期大小一致的2条目的条带；批间重复性试验结果显示，分别于3个不同的时间检测Pm DNA与RHDV cDNA的混合物均出现与预期大小一致的2条目的条带。

表明该双重PCR方法的重复性较好。

临床样品的检测结果

利用本实验建立的双重PCR方法与已报道的各病原单一PCR方法，分别对100份疑似感染兔的肺脏样品检测，结果显示，Pm阳性率为13%(13/100),RHDV阳性率为7%(7/100),Pm和RHDV混合感染阳性率为37%(37/100)，与已报道的各单一PCR方法的检测结果均一致，符合率为100%。

表明本研究建立的双重PCR方法准确性高，可以用于临床样品的检测。

讨论

随着我国实验兔的需求不断增加，实验兔的养殖规模迅速扩大，近年来，实验兔出现了一些新发的传染病，其中兔多杀性巴氏杆菌病和兔出血症是危害实验兔最为严重的两种传染病，给实验兔的养殖造成重大经济损失，严重制约我国实验兔养殖业的发展。

Pm和RHDV易与其他病原混合感染造成更严重的症状。

因此，当实验兔受到外界强烈刺激或感染其他病原菌时，易暴发这两种疾病并难以彻底净化。

此外，Pm属于人畜共患致病菌，给实验兔饲养者的健康造成严重威胁。

虽然已有Pm和RHDV的检测方法，如Yang等建立了用于检测RHDV的RT-PCR方法，特异性较强，敏感性约为1×104拷贝/μL，比血凝试验敏感性高1倍。

但这些方法仅能检测一种病原，对实验兔呼吸道疾病的诊断有一定的局限性。

因此，本研究针对Pm kmt1基因、RHDV VP60基因的保守区域设计并筛选出2对特异性引物，通过优化反应条件，建立了可以同时检测Pm和RHDV的双重PCR方法。

该方法特异性强，仅对Pm和RHDV有特异性扩增片段，而对兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种病原均无扩增条带。

与已报道的Pm和RHDV的双重PCR检测方法相比，该方法的敏感性更高，对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL，对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL，而刘梅等建立的双重PCR方法对Pm和RHDV重组质粒标准品的最低检测限分别为1.9×103拷贝/μL和1.34×104拷贝/μL，敏感性低于本研究建立的双重PCR方法。

但本研究建立的方法与上述方法均显示双重PCR对RHDV的检出敏感性低于对Pm的检出敏感性，提示双重PCR反应体系中可能存在干扰RHDV扩增的因素所致该方法对RHDV的扩增效率低于对Pm的扩增效率，后续将优化扩增体系以提高该方法对RHDV检测的敏感性。

重复性试验结果显示，该方法对Pm DNA与RHDV cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致，表明该方法的重复性和稳定性较好。

利用该方法检测患病兔的肺脏样品，结果显示Pm和RHDV的阳性率分别为13%和7%,Pm和RHDV的混合感染率为37%，与已报道检测方法的符合率均为100%，表明本研究建立的双重PCR方法准确性高，具有良好的临床应用价值。

综上所述，本研究针对Pm和RHDV两种呼吸道病原建立的双重PCR方法特异性强、敏感性和检测效率高、稳定性好，可以用于实验兔多杀性巴氏杆菌病和兔出血症的快速鉴别诊断，为预防实验兔的呼吸道疾病提供有力的技术支持，具有广阔的应用前景。

《兔多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增检测方法的建立》

《产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立》

《兔出血症病毒间接ELISA抗体检测方法的建立》

PCR实验小问题②——条带失踪

在我们的PCR实验中，结果条带会出现各种各样的问题，之前那期我们系统分析了可能会出现的非特异性扩增问题，那么今天我们就来一起讨论一下条带失踪的可能原因吧！

1. 引物。引物的质量、浓度都会影响我们最后的试验结果。①首先要确保我们的引物设计是否合理，引物长度，GC含量等均会影响试验结果。②引物浓度过低或不对等，引物一般稀释到100uM或10uM进行储存和使用，如果引物的浓度过低，或者一高一低，就会导致扩增结果的不理想。③引物质量问题。首先我们应该找到一个靠谱的引物合成机构，另外引物应该在稀释时进行少量分装，避免反复冻融或长期冷藏保存影响引物质量。

2. Mg2+离子浓度。Mg2+离子浓度是PCR扩增的重要影响因素，过高会降低PCR扩增的的特异性，出现杂带；过低则会导致PCR扩增产量低，甚至没有条带。

3. 酶。酶在PCR反应中非常关键，添加量虽然不多，但是一旦酶的活性过低，或酶完全失活，都会导致PCR反应失败，即没有目的条带。所以在使用新酶时我们要与旧酶进行比对验证，确保酶的质量没有问题，并且在保存过程中避免酶的反复冻融。

4. 模板。模板就是我们提取出来的生物体核酸，模板质量也会影响PCR的效果。①模板不纯，含有杂蛋白或者染色体中的组蛋白等蛋白质没有消除干净。②模板制备时裂解、消化不到位导致浓度过低，或根本没有提取出来核酸，也会导致目的条带不出。所以在提取核酸时一定要按照操作流程严谨制备，以防做了无用功哦！

5. PCR程序。变性是打开DNA双链的高温阶段，如果变性温度过低或时间过短，双链打开不彻底，则很有可能结果跑不出条带，即假阴性。也有可能是你仪器温度不准啦！

6. PCR体系。有一种最简单的可能，就是没有加全成分；或者体积扩大或缩小等多种情况导致的反应体系不合理也会让扩增结果不理想。

PCR技术说简单也简单，说复杂也很复杂，一点小的不足就很有可能与正确结果擦肩而过，此之谓牵一发而动全身。所以严谨的试验态度非常重要，同样重要的还有优质的试剂与仪器。三狮生物推出了多个种类、多种规格的核酸提取试剂盒，Taq酶，Taq酶预混液等普通PCR试验的全线商品，以及琼脂糖、TAE速溶粉末，核酸染料，上样缓冲液等全套琼脂糖凝胶电泳所需试剂，总有一款适合你，赶快行动起来吧！