木质素的代谢产物5-HydA和5-HydAlc的检测及化学合成具备哪些条件

阅读文章前辛苦您点下“关注”，方便讨论和分享，为了回馈您的支持，我将每日更新优质内容。

在植物生长和代谢过程中，木质素多酚是苯丙烷单元结构经过氧化偶联聚合而来的多一种酚类化合物。木质素可以简单地看作一种是由三个基苯苯丙烷单元通过化学键连接而成大分子。

目前木质素类型共有五种：H型-木质素、G型-木质素、S型-木质素、C型-木质素、5H型-木质素。它们的分子结构形成是通过木质素单体合成的，具体的木质素单体分别是香豆醇、松柏醇、芥子醇、咖啡醇和5-羟基松柏醇。

因此，木质素单体是形成木质素聚合物的重要物质。

5-HydA和5-HydAlc标准品溶液的制备

5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇的化学结构分别对应于下图的化合物，由于其易被氧化，因此合成上具有一定的困难。文献记载的合成方法有原料成本高，合成复杂等弊端。

从烯丙基化合物出发，先对两个酚羟基进行官能团的保护，羟基的保护最简单的是通过乙酰化和硅试剂进行保护，这两种保护基的脱保护也都比较容易。

考虑到乙酰化保护操作简单，成本低，初步考虑先对酚羟基进行乙酰化保护得到化合物。

分别准确称取5mg的2种代谢物标准品溶液（5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇）置于5mL容量瓶中，用100%色谱级甲醇脱气5min左右，待溶液完全溶解后。方可取出容量瓶放置在室温下降温至25℃左右，缓慢使用甲醇溶液对其进行定容。

然后对溶液过滤，并使用逐级稀释的方法配成一系列梯度浓度的混合溶液，每个梯度标准品溶液为1mg/mL。所述2种代谢物与色谱级甲醇关系为（0.5~2）mg:1mL，以便备用。

线性回归方程的构建

根据不同物质质谱响应信号的差异，将5-羟基松柏醛/醇标准品，分别溶于5mL100%色谱级甲醇溶液中。

接着，将其分别稀释成0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.7μg/mL、0.9μg/mL的标准溶液，通过标准品溶液含量的检测，分别得到两种样品的标准曲线。

样品溶液的制备

分别取15、39、47、55、63、79和102DAF（花后天数）的梨果实各15个，对其进行切割。分别称取2g的待测物与30mL质量浓度为90%的乙醇水溶液混合，然后在70℃下进行超声提取40min，6000r/min离心12min。

离心后缓慢取上清液部分并使用氮气进行吹干，再向其中缓慢加入2mL100%色谱级甲醇再一次溶解并过滤，所得的不同滤液作为样品溶液待用。

待测样品HPLC检测

采用高效液相色谱法分别测定待测样品中5-羟基松柏醛、5-羟基松柏醇的吸光度。测定条件如下：所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，具体为第一梯度洗脱、第二梯度洗脱、第三梯度洗脱和第四梯度洗脱。

梯度洗脱中洗脱剂包括甲醇和水，对于不同梯度，甲醇和水的比例也会有所不同，第一梯度洗脱、第二梯度洗脱、第三梯度洗脱、第四梯度洗脱梯度洗脱所用洗脱剂中甲醇的体积浓度依次增加10~20%。

比例组成具体为：第一梯度洗脱用洗脱剂中甲醇和水的体积比为10:90；第二梯度为20:80；第三梯度为30:70；第四梯度为40:60。

所述第一梯度洗脱、第二梯度洗脱、第三梯度洗脱和第四梯度洗脱的洗脱时间独立地为0~50min。所述四个梯度的洗脱时间具体为：第一梯度洗脱的时间为0~15min；第二梯度为15~35min；第三梯度为35~45min；第四梯度为45~50min。

所述四个梯度中洗脱剂的流速独立地为0.8~1.2mL/min；按照此条件，使用ChromQuest软件（ThermoQuestItaliaS.p.A.）进行对数据采集和分析处理，可得到待测样品的HPLC图。用于对梨果实不同发育时期5-羟基松柏醛、5-羟基松柏醇定性和定量分析。

根据标准品与样品溶液的色谱峰的保留时间可确定样品中是否含有目标代谢产物，即可对梨果实发育目标代谢物进行定性。

采用HPLC检测得到待测样品中目标检测物的高效液相色谱图，能够同时得到5-羟基松柏醛/醇的吸收峰面积，通过对应吸收峰面积分别代入标准曲线中，即可得到待测样品中目标检测物的浓度。

对于不同梨果实的发育时期的5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇的浓度每次做三组生物学重复，取相对应的平均值含量绘制5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇的柱状图，可明显看出不同梨果实发育时期中5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇的变化趋势。

HydA和5-HydAlc化学合成条件分析

在木质素代谢途径中，5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇代谢流向尚不明确。主要通过化学合成的方法，得到5-羟基松柏醛/醇进行生物学研究。

但是由于合成原料3，4-二羟基-5甲氧基烯丙基苯相对比较复杂，先以简单易得的丁香酚为起始原料进行条件的摸索，考虑到它的结构特征，在标准条件下先将丁香酚进行乙酰化保护，从而避免了在接下来氧化过程中对酚羟基的影响。

根据先前的研究，将通过乙酰化保护的化合物进行氧化，按照不同的反应条件进行筛选，找到适宜的合成条件。在DDQ作为催化剂，DCE作为溶剂下，60℃进行氧化反应，可以很好地得到相应的氧化产物。该反应易于操作而没有苛刻的条件，并且纯化非常简单。

以高收率获得所需的氧化产物。然后进行脱乙酰化，对于脱乙酰基反应中，由于该反应条件相对比较成熟，但要考虑到最终产物酚醛和酚醇的不稳定性。

该反应条件温和，为了避免强酸和强碱条件对醛基和羟基等不稳定官能团的破坏。一般是NaHCO3在CH3OH和H2O混合在溶剂中，室温条件下过夜搅拌。结果也很好，并以极好的收率得到松柏醛，进一步通过还原反应得到松柏醇。

然后按照相同的设计路线，最终合成5-羟基松柏醛/醇目标化合物，以此用合成的化合物作为标品，使用HPLC的方法对梨果实中5-羟基松柏醛/醇的含量进行定性和定量分析，为进一步阐明石细胞的发育和改善梨果实品质奠定理论基础。

HydA和5-HydAlc化学合成方法

合成5-羟基松柏醛/醇起始原料是3，4-二羟基-5甲氧基烯丙基苯，但是此原料目前在市场上无法对其直接进行商业化或对外购买得到，需要进一步的化学合成。

因此在实验的初期希望用结构类似的丁香酚来替代3，4-二羟基-5甲氧基烯丙基苯。丁香酚的结构与3，4-二羟基-5甲氧基烯丙基苯结构的差别是苯环上少一个羟基，但是其来源广泛，可以直接购买而且价格非常便宜（100g，85元，安耐吉化学试剂公司）。

因此我们设计合成路线，先将丁香酚进行乙酰化保护得到化合物7，然后以化合物7为模板反应原料重点讨论烯丙基氧化得到化合物8，然后去乙酰化得到松柏醛化合物9和松柏醇化合物10。

通过此模板反应建立有效的合成方法再应用于5-羟基松柏醛/醇的合成。

按照上述的设计路线，首先以4-羟基烯丙基苯（化合物6，丁香酚）为条件摸索，具体反应化合物7的合成，具体实验步骤如下：向干燥的1L圆底烧瓶中加入丁香酚6（3.28g，20.0mmol），三乙胺（8.3mL，60.0mmol）和CH2Cl2溶剂（100mL），然后在冰浴搅拌下慢慢地加乙酸酐（5.7mL，60.0mmol），完成后在室温条件下反应3h，待反应完全后，用EtOAc萃取有机物，使用旋转蒸发仪将其浓缩至干燥。加入适量的硅胶粉末并继续浓缩。

然后缓慢倒入硅胶柱中，在不同化学极性条件下进行洗脱，浓缩后经核磁确认后即可得到所需产物7（3.71g，产率为90%）。化合物8的合成，首先以化合物7为底物探索其发生氧化反应得到化合物8的适宜反应条件，分别筛选氧化剂的种类、氧化剂的量、溶剂的种类、温度等对该反应效率的影响。

在控制变量的前提下，首先在无氧化剂的添加下进行反应，在CH3NO2的条件下，以此想得到目标产物8，但结果并没有达到预期的目的。

随后在氧气作为氧化剂条件下，先后加入PdCl2、Pd（OAc）2催化剂，并没有得到很明显的改善，当加入1.0当量的氧化剂DDQ时，得到目标产物38%。

在此基础上为了增加反应产率，尝试了在添加不同的溶剂下对反应产率的影响，发现在加入CH3NO2、1.4-Dioxane、Cyclohexane、DME不同的溶剂时，可以看出在DCE作为溶剂的条件下，产率相对比较好，达到41%。

随后改变氧化剂的量，都得到明显的提高，即2.0当量（62%）、2.5当量（60%）、2.2当量（65%）。

当控制氧化剂DDQ的含量不变时，通过升高温度发现，在反应温度为50℃和60℃时，从反应结果可以看出产率都会有所提高，但反应产率基本无差别，不过在60℃的条件下相对较好，产率为76%。

当继续升高温度至70℃时，产率并没有明显的改善。可以得出当继续升高温度时可能并不会对反应的产率有所提高。

根据上述摸索的结果，适宜的条件为DDQ（氧化剂，2.2equiv.），H2O（2.0equiv.），DCE（溶剂，1.5mL），温度为60℃下连续反应6h，在此条件下可以得到最高的产率为76%，根据以上条件的摸索结果，对7化合物进行氧化，可得到化合物8。

具体反应步骤如下：向烘箱干燥的管中加入DDQ（149.8mg，0.66mmol），H2O（10.8mg，0.6mmol）的DCE（1mL）溶液，然后添加溶解在DCE（0.5mL）中的起始原料7（61.9mg，0.3mmol）。将反应在空气条件下于60℃搅拌6h。

待反应完成后，将混合物冷却至室温并使用饱和Na2CO3（5mL）中和，以便去掉剩余的DDQ。然后用饱和盐水（10mL）稀释，并用EtOAc（15mL，3次）萃取。

进行旋干浓缩，待完全旋干前向溶液中缓慢加入适量的硅胶粉末并继续浓缩。然后缓慢倒入硅胶柱中进行洗脱，之后按照不同的极性进行浓缩，经核磁确认后即可得到所需产物8（50.2mg，产率为86%）。

参考文献：史起鹏.Cα-OH生物氧化增强木质素的甲酸催化解聚研究[D].华中科技大学，2019.李腾飞.低共熔溶剂分离提取竹柳木质素研究[D].齐鲁工业大学，2018.聂敬全.砀山酥梨果实石细胞解剖学研究及木质素合成途径的初步分析[D].安徽农业大学，2009.王星，罗双霞，于萍，等.茄科蔬菜苯丙烷类代谢及相关酶基因研究进展[J].园艺学报，2017，44(9):1738-1748.

土工合成材料

土工合成材料质量轻，整体连续性好，抗拉强度较高，耐腐蚀，抗微生物侵蚀好，施工方便。钢筋接头宜采用焊接接头和机械连接接头，其中，焊接接头优选闪光对焊，机械连接接头适用于HRB335和HRB400常肋钢筋的连接。钢板桩围堰适用于深水或深基坑，流速较大的砂类士，黏性土，碎不土和风化岩等坚硬河床。施打时必须有导向设备，以保证钢板桩正确位置。施打前，应对钢板桩的锁口用止水材料捻缝，以防渗水。施打顺序一般从上游向下游合龙。